10x Genomics单细胞测序+多色免疫荧光+Leica共聚焦,又是一篇好文章!

单细胞测序结合多色免疫荧光技术助力大脑视觉相关类器官研究

类器官,顾名思义,是和人体器官具有高度相似性的组织,是研究人员们在实验室利用干细胞分化而成的产物。类器官技术的蓬勃发展,为科学家们提供了一个强有力的实验模型,帮助更加深入地了解人体的发育,疾病的发生等。在脑科学研究领域,类器官发挥了极大的作用,通过模拟大脑发育环境,利用诱导多能干细胞(iPSCs)分化产生类似人脑的3D组织,用来研究大脑发育、疾病发生以及药物疗效等,为研究和理解大脑功能和神经疾病的机理提供了前所未有的机遇。

眼睛的发育是一个非常复杂的过程,而理解这个过程,对于研究早期视网膜相关疾病意义重大。在正常胚胎发育过程中,视网膜原基起源于前脑区域的间脑两侧,随后在间脑远端产生视杯(optic cup,视觉系统重要组成部分)。因此,在研究视网膜的早期发育时,大脑所起到的作用不容忽视。之前有研究用人类胚胎干细胞制造了视杯,并产生了视网膜。也有研究表明,视杯样结构可以从iPSCs中产生。但过去用多能干细胞衍生视杯主要是为了产生视网膜,人们未能将视杯和其他3D视网膜结构在功能上整合到大脑类器官中。

来自德国杜赛尔多夫海因里希海涅大学的Jay Gopalakrishnan团队在Cell Stem Cell杂志发表了题为Human brain organoids assemble functionally integrated bilateral optic vesicles的研究论文。研究人员成功地在大脑类器官中诱导出了双侧对称视杯,并发现这种结构可以感知光线,同时将信号发送给大脑的其他区域。这篇工作验证了大脑类器官产生原始视觉结构的能力,研究了胚胎发育期间的脑—眼相互作用。利用scRNA-seq(10x Genomics)+免疫荧光技术+Leica SP8激光共聚焦,详细分析了视觉系统发育过程中的多样化细胞类型以及具体的结构演变过程。

图1 大脑类器官发育形成视泡的过程

01.单细胞测序探究大脑类器官发育过程中细胞多样性变化

为了研究细胞多样性,作者对培养了30天的大脑类器官进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq),并分析了 3,511 个单细胞的转录组。聚类分析揭示了八个主要的不同转录细胞簇(簇 C1-C8)(图2)。其中包含神经祖细胞、与前神经管混合的腹侧前脑祖细胞、背侧皮质祖细胞和背侧皮质神经元 (C1-C4) 的细胞簇。作者还鉴定了发育中的视泡(视杯早期结构) (C6) 和视前区 (C7) 的细胞簇,它们与神经元细胞类型分离,这验证了大脑类器官存在视觉系统发育的趋势。

图2 30天龄大脑类器官单细胞转录组聚类分析

随后,作者进一步对发育出视泡的大脑类器官(optic vesicle-containing brain organoids,OVB-organoids)进行单细胞RNA测序,研究其具体发育情况。作者从7298个单细胞转录组数据中鉴定了12种细胞类群,其中与视觉紧密相关的包括早期眼睛发育(C5 和 C11)、间脑(C7)、放射状神经胶质细胞(C11)簇。这些簇包含表达 OTX2 的细胞,能够激活下游转录因子 PRDM11 和 VSX2,以调节光感受器和双极细胞;还含有调节神经节细胞、视锥细胞和无长突细胞(例如 ONECUT1/2 和 NEFL)发育的因子;此外,这些簇中的细胞还表达 FOXG1、SOX2 和 HES1细胞因子。其中,HES1 是一种转录抑制因子,对视网膜神经发生的时间至关重要(图 3);C5、C7 和 C11 簇还包含非神经外胚层 (NNE)、前基板外胚层 (PPE) 和晶状体外胚层细胞簇(DLX5、DLX6、BMP7、MAB21L1、MEIS1、MEIS2 和 EYA2)。PPE 包含神经源性和非神经源性基板,它们产生眼表外胚层,表明 OVB 类器官可能包括非神经元细胞类型的视泡,在未来能够发育形成其他的视觉结构,例如晶状体和角膜等。

图3 形成视泡的大脑类器官单细胞转录组测序揭示大脑早期视网膜和眼睛相关细胞类群

02.免疫荧光+Leica SP8共聚焦验证大脑类器官发育过程中眼睛相关生物标志物

作者利用免疫荧光技术标记眼睛相关生物标志物结合共聚焦显微镜,先对发育30天的大脑类器官样本进行成像,结果显示RAX, Pax6和FOXG1免疫荧光信号呈阳性(图4C-D),还观察到突出的SOX2阳性内陷区,显示出VSX2和FOXG1梯度表达,表明类器官的视觉区域与前脑区分离(图4E-F)。

图4 大脑类器官发育形成视觉相关色素结构

随后,作者对发育了60天,形成了视泡结构的大脑类器官(OVB-organoids)样本进行共聚焦成像,分析了早期视网膜发生相关的生物标志物,包括VSX2(神经视网膜祖细胞)、Recoverin、CRX和NRL,并以视网膜类器官作为对照。相比OVB类器官,视网膜类器官呈典型球形(图D-J)。

图5 大脑类器官发育形成神经视网膜结构

然后作者研究了OVB类器官是否含有原始晶状体和角膜上皮样细胞等来自于表面外胚层的非神经元细胞类型。共聚焦图像显示位于每个视神经囊泡内的双侧αA/αB -晶体蛋白阳性(图6 A),这些结构被一层F -actin和Keratin-3阳性柱状上皮细胞包围,表明原始角膜上皮样层与晶状体样结构相邻(图6 B)。并在视神经泡附近发现了PCP4阳性细胞,PCP4阳性细胞呈典型的体细胞形态,轴突延伸至100mm,穿透出视神经囊泡,从器官前部向后部迁移,表明PCP4阳性神经元可能已经从视泡迁移到更高阶的视觉区域(图6 E-F)。基于此,作者验证了他们所设计的能够发育出视泡的大脑类器官同时还包含后续眼睛结构发育的各种细胞类型。

图6 大脑类器官发育形成原始晶状体和角膜相关细胞类型

借助10x Genomics和Leica的强有力工具,结合转录组和蛋白组数据研究了人脑类器官双侧视神经泡发育形成过程中多样的细胞类型。揭示实验室培养类器官与人眼胚胎发育的相似性,为使用同一类器官研究不同器官(脑-眼)之间的相互作用提供了方法与方向,也为视网膜疾病机制和治疗的研究提供了新的强大工具。

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